נעמי פולני נולדה בתל אביב בשנת 1927, נכדתו של ד"ר חיים חיסין, ממייסדי העיר, ולמדה בגימנסיה 'הרצליה', בה היתה חברת מקהלה.

היא היתה חברת ההכשרה המגוייסת בקיבוץ חצרים, למדה משחק בתיאטרון 'האהל' ומחול אצל גרטרוד קראוס. לאחר גיוסה לפלמ"ח היא שרתה בפלוגה ג' ובהכשרה של 'הנוער העובד' בקיבוץ אפיקים וליוותה שיירות לירושלים.

עם הקמת הצ'יזבטרון, המליץ שייקה אופיר על הנערה בעלת הקול הערב והכישרון הקומי אותה הכיר בסטודיו למשחק של תיאטרון 'האהל', וכך הגיעה נעמי פולני לצ'יזבטרון. נעמי פולני ושייקה אופיר היו עמוד התווך של הלהקה, וזכורים במיוחד שירת הסולו שלה בשיר 'היו זמנים' והדואט עם שייקה אופיר בשיר 'היי הג'יפ'. כפי שהגדיר אותם הפזמונאי עלי מוהר, השניים נחשבים עד היום ל"אב הגדול והאם הגדולה של הבידור הישראלי לדורותיו".

עם פירוק הצ'יזבטרון לאחר המלחמה, למדה פולני מוסיקה אצל הרברט ברין, תנועה וקומפוזיציה אצל נועה אשכול ושיחקה בתיאטרון הקאמרי. בשנת 1957 הזמין שאול ביבר, קצין החינוך של גייסות השריון את נעמי פולני, אותה הכיר מהפלמ"ח, לביים ולנהל את להקת גייסות השריון. ב-1959 מונתה נעמי פולני לאחראית העמדת הפזמונים בתכניתה של להקת הנח"ל 'בדרך כלל' (לצידו של הבמאי, יוסי בנאי). להקות אלה היו עדיין בראשית דרכן ובמסגרתן יצרה פולני סגנון חדש בהעמדת פזמונים, בעיבודים הקוליים, בדיקציה ובתנועה.
נעמי פולני הפכה לסמכות אמנותית עבור הלהקות הצבאיות בכוח אישיותה, מקצועיותה, תשומת הלב לפרטים ודרישותיה האמנותיות הבלתי מתפשרות. סגנון זה הפך מודל להופעה שהתקבע בלהקות הצבאיות במשך שנים רבות.

ב-1960 חברו יחדיו שמונה בוגרי להקות צבאיות תחת ניהולה ובימויה של נעמי פולני, והקימו את להקת 'התרנגולים', מהלהקות המצליחות ביותר ששיריה הפכו לנכסי צאן ברזל בזמר העברי. חלק מרפרטואר הלהקה נלקח משירי הלהקות הצבאיות (כולל הצ'יזבטרון) והם זכו לעיבוד והעמדה חדשים תחת שרביטה של פולני. גם את ההרכב השני של 'התרנגולים' ניהלה פולני עד לפירוק הלהקה ב-1963. ב-1966הקימו ארבעה מחברי 'התרנגולים' את 'החמציצים', שוב בניהולה האמנותי של נעמי פולני, אך הלהקה לא זכתה להצלחה והתפרקה לאחר זמן קצר.

לאחר מכן שימשה פולני כמעבדת מוזיקלית במספר תוכניות רדיו בקול ישראל, עסקה בלימוד מוזיקה ובימוי אירועים שונים באזור מגוריה בעמק הירדן, ואף הדריכה תלמידים בבי"ס למוסיקה "רימון" במשך מספר שנים. בשנת 2006 שיחקה פולני בסרטו של עודד דוידוף, 'מישהו לרוץ איתו', וב- 13 בנובמבר 2007 קיבלה נעמי פולני את פרס אקו"ם על מפעל חיים.